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微孔过滤器

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基于微孔过滤板的蛋白吸附高通量筛选方法

发布时间:2017-06-17 10:51:34 5年前 热度:5944 ℃

摘要:针对色谱分离过程优化,建立了基于微孔过滤板的蛋白吸附高通量筛选方法,用于介质初筛、吸附性能考 察、吸附等温线和吸附动力学测定、吸附和洗脱条件优化等。首先优化了 96 孔过滤板的操作参数,以 2 种离子交 换介质和 2 种混合模式介质为典型代表,采用微孔过滤板方法考察了不同介质和液相条件下牛血清白蛋白的吸附, 得到结合载量分布图,确定了合适的蛋白吸附和解吸条件。进一步测定了 4 种介质在特定吸附条件下的吸附等温 线和吸附动力学曲线,获得吸附相关参数。最后,采用微孔过滤板进行了洗脱条件优化,并与填充柱色谱分离进

行比较,验证了方法的可靠性。结果表明,基于微孔过滤板的蛋白吸附高通量筛选是切实可行的,可以快速筛选

色谱介质和液相,优化蛋白分离条件,具有资源消耗小、实验通量大、研发周期短、适用性广、稳定性高的特点, 是蛋白色谱分离过程优化的一种新方法。 关键词:高通量筛选;微孔过滤板;色谱分离;吸附;蛋白分离 


目前生物制品的质量要求不断提高,研发难度 和成本不断增加[1]。鉴于生物对象的特殊性和复杂 性,制备过程的优化通常比较繁杂,涉及因素很多, 往往难以系统优化,寻求高效、简便、快速的过程 开发方法成为当前的研究热点[2]。引入高通量过程 开发(high-throughput process development, HTPD) 理念,提高过程通量,可以达到事半功倍的效果, 已应用于菌种筛选[3-5]、培养过程优化[6-8]和下游纯 化工艺开发[9-12]。应用于色谱分离的 HTPD 主要采 用 DoE、演化算法或数学模型等设计手段,利用手 动或者自动系统进行高通量实验,基于数据分析评 价实验结果,优化分离条件[13-14]。Rege 等[15]应用 HTPD 进行重组 α-淀粉酶色谱分离的介质筛选和条 件优化,直接转化到较大规模的蛋白纯化。Nfor 等[16]采用HTPD评价4种混合模式介质和6种蛋白 的吸附等温线,为蛋白分离纯化提供指导。 Bergander 等[17]采用 HTPD 研究多克隆人 IgG 和亲 和介质MabSelect SuRe间的吸附动力学和动态结合 载量。结果表明,引入 HTPD 有效减少了试剂用量, 增大了过程通量,提高了研发效率,达到快速确定 色谱分离工艺的目的。

 HTPD 应用于色谱过程开发主要有 3 种模式, 微孔过滤板、微量移液色谱柱和微升填充柱,具体 见图 1。

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不同模式在操作方法和使用范围等方面有 较大差别,微孔过滤板的介质量为 2~50 μl,灵活 性高,便于改变介质种类和添加量;微量移液色谱柱的介质量为 5~320 μl,微升填充柱的介质量为 50~200 μl,一般只能使用预装柱。微孔过滤板属 于分批加样操作,实验通量大,可手动操作,适合 大量条件的筛选;微量移液色谱柱和微升填充柱类 似于固定床操作,一般采用自动加液系统,适合考 察上样量和洗脱条件,优化色谱分离[18]。相比较而 言,微孔过滤板模式最为通用,适用范围广,且无 需自动加液平台,关键是必须合理设计流程,优化 各项参数,尽量减少微量操作造成的误差,才能达 到常规色谱分离一致的结果。 

离子交换色谱是应用最广泛的色谱分离方法, 而混合模式色谱是近年来迅速发展的新型蛋白分离 技术[19-26]。本文将基于微孔过滤板法,以牛血清白 蛋白(bovine serum albumin,BSA)为模型蛋白,2 种离子交换介质(Q Sepharose FF 和 SP Sepharose FF)和 2 种混合模式介质(Capto adhere 和 Capto MMC)为典型代表,探讨 HTPD 用于色谱分离过 程开发的全过程,包括介质初步筛选、吸附性能考 察、吸附等温线和吸附动力学测定、柱吸附和洗脱 条件优化,优化实验条件,确定评价方式,建立一 套快速优化色谱分离过程的方法,为蛋白色谱分离 工艺的开发提供新方法。 

1  材料和方法 

1.1  主要材料与仪器 色谱介质:Q Sepharose FF、SP Sepharose FF、 Capto adhere 和 Capto MMC,购自 GE Healthcare 公 司,配基结构见图 2。

牛血清白蛋白(等电点 4.7,分子量66700):生工生物工程有限责任公司;

MultiScreen HTS BV 型96 孔过滤板和MSVMHTS00 真空多联装置:默克密理博公司;恒温振荡仪:赛默飞世尔科技公司;AKTA explorer 100色谱分离系统和Tricorn 5/50 色谱柱(内径5 mm,柱长50 mm): GE Healthcare 公司; OneDropOD-1000+分光光度计:南京五义科技有限公司;其他试剂均为市售分析纯。

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1.2 微孔过滤板HTPD 流程

微孔过滤板HTPD 系统主要由96 孔过滤板、恒温振荡仪、真空多联装置、微量分光光度计或酶标仪构成(图3)。一般流程如下:

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(1)配制介质悬液(体积比1∶10),充分混合,通过移液器定量添加到96 孔过滤板中,真空抽滤去除溶液,去离子水和平衡缓冲液(200 μl)冲洗多次;

(2)添加样品(200 μl)到96 孔过滤板,封板膜密封孔板顶部和底部,盖上过滤板盖,置于恒温振荡仪孵育,控制温度,保证样品充分混合;

(3)达到吸附平衡后,移去板盖,将96 孔过滤板放置到真空多联装置中,采用真空抽滤方式转移板内液体,收集到96 孔板中;

(4)采用微量分光光度计或酶标仪测定各收集孔内溶液的吸光值,得到蛋白浓度,依据吸附前后的物料平衡计算每个孔板的蛋白吸附量;

(5)添加清洗液,按照步骤(2)~步骤(4)重复操作,测定清洗蛋白量;

(6)添加洗脱液,同样按照步骤(2)~步骤

(4)重复操作,测定洗脱蛋白量;

(7)添加平衡缓冲液进行再平衡后,可重复进行蛋白吸附性能考察。

1.2.1 吸附/解吸条件筛选 在相同蛋白浓度和介质加入量条件下,考察不同介质在不同液相条件下

的蛋白吸附量,从而确定合适的介质和吸附/解吸条件。配制不同pH 和盐浓度的BSA 溶液,包括8 个

pH 水平,每个pH 包含12 种不同NaCl 浓度;添加介质和200 μl 蛋白溶液到96 孔过滤板,25 ℃、1500r·min−1 金属浴恒温振荡3 h;吸附平衡后,收集溶液,280 nm 波长测定蛋白浓度,计算介质的蛋白吸附量,绘出不同pH 和盐浓度条件的结合载量分布图。

1.2.2 静态吸附平衡实验 在特定液相条件下,考察介质在不同蛋白浓度下的吸附量,得到吸附等温线。选择合适缓冲液配制0.5、1、2、4、6、8、10 mg·ml−1的BSA 溶液。添加200 μl 到96 孔过滤板,恒温振荡达到吸附平衡,计算介质的蛋白吸附量,以溶液的平衡蛋白浓度为横坐标,介质的蛋白吸附量为纵坐标,得到吸附等温线,并用Langmuir 方程拟合吸附等温线,方程如下

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式中,Q*为介质的平衡吸附量;C*为平衡时液相的蛋白浓度;Qm 为饱和吸附容量;Kd 为解离常数。

1.2.3 吸附动力学实验 在特定液相和蛋白浓度下,考察介质在不同时刻的蛋白吸附量,得到吸附动力学曲线,了解蛋白的吸附动力学过程。其他实验条件不变,缓冲液配制5 mg·ml−1 的BSA 溶液,通过改变介质的恒温孵育时间得到不同吸附时间的蛋白吸附量,吸附时间长的介质先添加蛋白样品,吸附时间短的介质后添加,控制吸附时间分别为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50 和60 min。以吸附时间为横坐标,蛋白吸附量为纵坐标,得到吸附动力学曲线,采用孔扩散模型拟合得到有效扩散系数De。

1.2.4 洗脱条件优化 模拟色谱柱内的蛋白吸附和洗脱过程,考察不同洗脱条件对蛋白解吸的影响,优化蛋白洗脱条件。在相同的介质量下,加入200 μl相同浓度的BSA 溶液,保持介质的上样量一致,恒温振荡,真空抽滤收集未结合的蛋白溶液;模拟色谱柱pH 阶跃洗脱过程,添加不同pH 的洗脱溶液,恒温振荡10 min,收集蛋白洗脱液,测定并计算相应条件下的蛋白洗脱收率。

1.2.5 柱色谱分离实验 穿透曲线:取1 ml 介质填充于Tricorn 5/50 色谱柱,高度约5 cm,样品为BSA溶液,上样浓度5 mg·ml−1,流速0.5 ml·min−1。UV检测器检测穿透液中蛋白浓度,绘制蛋白穿透曲线,考察不同液相条件下10%蛋白穿透的动态结合载量(DBC10%)。

色谱分离:取1 ml 介质填充于Tricorn 5/50 色谱柱,高度约5 cm,样品为BSA 溶液,上样浓度5mg·ml−1,流速0.5 ml·min−1。色谱分离过程包括平衡、上样、冲洗、洗脱,最后以1 mol·L−1 NaCl+1mol·L−1 NaOH 溶液进行原位清洗再生。考察不同上样和洗脱条件下蛋白的洗脱收率,验证HTPD 确定的分离条件。

2 结果与讨论

色谱分离过程优化通常包括介质初筛、吸附性能考察、吸附等温线和吸附动力学测定、柱吸附和洗脱条件优化等,基于微孔过滤板的HTPD 可以用于上述的全过程。

(1)介质筛选,微孔过滤板适用于筛选众多的色谱介质,如96 孔板可以同时考察96 种介质,并保持其他条件完全相同,克服传统方法逐一考察和评价的缺点;

(2)吸附性能考察,可以在一个过滤板中考察不同液相条件的蛋白吸附量,确定吸附和解吸条件,相比传统方法介质和蛋白样品用量显著减少,过程一致性提高;

(3)吸附等温线和吸附动力学测定,可以在特定液相条件下系统考察介质的静态吸附平衡和吸附动力学性质,为后续色谱分离提供指导;

(4)洗脱条件优化,保持吸附条件一致,可以在一个过滤板中考察介质在不同液相条件下的洗脱效果,确定合适的洗脱条件,提高分离效率。

2.1 基于微孔过滤板的HTPD 基本参数优化为了减少微量操作带来的实验误差,优化了微孔过滤板法HTPD 的基本操作参数,系统考察了液固相比、恒温振荡转速和孵育时间的影响。在液相体积(200 μl)不变的条件下,比较了液固体积比为10、15、20、30、40 时的蛋白吸附等温线,发现液固相比为15 时数据波动小,重现性好,确定最佳相比15,相应的介质体积14 μl。考察了恒温振荡转速对介质吸附等温线的影响,发现影响显著,当转速大于1100 r·min−1 时,吸附数据稳定可靠,为了尽可能消除混合不良造成的影响,选定恒温振荡转速为1500 r·min−1。进一步考察了恒温孵育时间的影响,发现大于3 h 时吸附完全达到平衡,因此后续实验采用孵育时间3 h。

2.2 介质筛选和吸附性能初步评价

选择两种典型的离子交换介质Q Sepharose FF和SP Sepharose FF,以及两种新型混合模式介质

Capto adhere 和Capto MMC 作为代表,在8 个pH水平(4~9)和12 种盐浓度(0~0.4 mol·L−1 NaCl)条件下,比较BSA 的吸附效果。以pH 为横坐标,盐浓度为纵坐标,得到不同介质的蛋白结合载量分布,结果如图4 所示。

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根据结合载量分布图,可以系统分析不同液相条件的影响,比较不同介质的差异,从而筛选合适的介质和吸附条件。结果表明,两种具有季铵基团的阴离子交换型介质QSepharose FF 和Capto adhere 的吸附趋势基本一致,在低盐、高pH(pH 9.0)或BSA等电点附近(pH 5.5),具有较高的吸附容量(大于80 mg·ml−1)。相比较而言,随盐浓度增大,离子交换介质Q Sepharose FF的吸附容量急剧下降,而混合模式介质Capto adhere表现出一定的耐盐特性,特别是高pH 条件下。例如,在pH 9.0 和400 mmol·L−1 NaCl 条件下,Captoadhere 仍具有39.3 mg·ml−1 吸附容量, 而QSepharose FF 仅为3.5 mg·ml−1。两种阳离子交换型介质SP Sepharose FF 和Capto MMC 的趋势也基本一致,在低pH 下吸附容量较高,而高pH 下显著下降。相比较而言,混合模式介质Capto MMC 对pH的敏感程度较低,且具有较好的耐盐吸附性,在较宽pH(3.0~5.0)和盐浓度(0~400 mmol·L−1 NaCl)

范围内吸附容量保持在80 mg·ml−1 左右,变化很小。

实验结果与离子交换介质和混合模式介质的基本特征一致,对于阴离子交换型介质Q SepharoseFF和Capto adhere,当pH 大于BSA 等电点,蛋白带有负电荷,与介质配基产生强的静电相互作用,因此碱性条件促进蛋白吸附;对于阳离子交换型介质SP Sepharose FF 和Capto MMC,当pH 小于BSA等电点,蛋白带有正电荷,因此酸性条件下的静电相互作用促进BSA 吸附;两种混合模式介质Captoadhere 和Capto MMC,除了离子交换基团外,还带有苯环等疏水作用基团,因此高盐浓度下静电作用被屏蔽但疏水相互作用得到加强,体现出一定的耐盐吸附特性。对于Q Sepharose FF 和Capto adhere,在BSA 等电点附近,吸附容量也较高,可能是蛋白表面电荷分布的不均匀性和弱疏水作用引起[27],两种介质可通过弱静电吸引和疏水相互作用吸附BSA。

2.3 吸附等温线基于上述不同介质的吸附条件筛选,进一步利用微孔过滤板,考察特定吸附条件下的吸附等温线。介质和蛋白溶液量保持不变,每种介质考察8 个蛋白浓度的平衡吸附量,平行测定两组,因此96 孔板一次可以得到6 组不同介质和条件的吸附等温线。分别考察了Q Sepharose FF 和Capto adhere 在两个pH(8.5 和5.5)、SP Sepharose FF 和Capto MMC 在pH 4.0 时的吸附等温线,Langmuir 吸附等温式拟合,结果见图5。

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可以发现,4 种介质的吸附等温线均符合Langmuir 等温式,在所选定的条件下,均有较高的饱和吸附容量Qm 和较低的解离常数Kd,说明吸附性能良好。Liu 等[28]采用传统方法测定了pH 8.0下QSepharose FF 对BSA 的饱和吸附量Qm 为137mg·ml−1±5 mg·ml−1,与本文结果152 mg·ml−1(pH8.5)较接近。相比其他介质,SP Sepharose FF 对BSA 的吸附量较高,Qm 达到226.2 mg·ml−1, Yang[29]采用传统方法测定的Qm 值为194.7 mg·ml−1,与本文结果也较接近。结果表明,基于微孔过滤板的蛋白吸附等温线测定是切实可行的,具有通量大、物耗小、时间短的HTPD 优势。

2.4 吸附动力学

利用微孔过滤板考察了特定吸附条件下的吸附动力学曲线。介质、样品体积和液相条件保持不变,每种介质考察16 个时间点的蛋白吸附率,96孔板一次可以得到6 组不同介质和液相条件的吸附动力学曲线,采用孔扩散模型拟合得到有效孔扩散系数De。对于Q Sepharose FF 和Capto adhere 两种介质,在pH 8.5 时的De 值分别为5.0×10−12 和2.5×10−12 m2·s−1,pH 5.5 时分别为2.05×10−11 和3.2×10−12 m2·s−1。SP Sepharose FF 和Capto MMC 在pH 4.0 时的孔扩散系数De 分别1.09×10−11 和5.6×10−12 m2·s−1。进一步比较了1 ml 离心管和50 ml烧杯内测定的吸附动力学曲线,发现基本一致,表明微孔过滤板的方法是可靠的。Liu 等[28]在200 ml的三口圆底烧瓶中测定Q Sepharose FF 吸附BSA的吸附动力学曲线(pH 8.0),得到De 值约为6×10−12m2·s−1,和本文微孔过滤板测得De 值相一致。Yang等[30] 在250 ml 的三口圆底烧瓶中测定了SPSepharose FF 吸附BSA 的吸附动力学曲线(pH4.5),拟合得到De 值为7.27×10−12 m2·s−1,也和本文结果基本一致。

2.5 吸附和洗脱优化

基于前文所确定的吸附和解吸条件,进一步利用微孔过滤板,考察不同洗脱条件下的洗脱效果,优化蛋白分离过程。保持介质、样品体积和蛋白吸附条件保持不变,每种介质考察16 种不同的洗脱条件(pH 和盐浓度),96 孔板一次可以得到6 组不同介质和洗脱条件的结果。结果表明,在加盐(0.4mol·L−1 NaCl)条件下,不同pH 条件下Q SepharoseFF 的蛋白洗脱收率均大于90%;不加盐且pH 小于4.0 时,降低pH 同样可以得到较好的洗脱效果。由于Capto adhere 的耐盐吸附特性,在加盐条件下的洗脱效果较差,仅当pH 小于4.0 时洗脱收率达到80%;不加盐且pH 小于4.0 时,洗脱收率大于90%。对于两种阳离子交换型介质,Capto MMC 在加盐且pH 大于6.0 时,洗脱收率大于85%;不加盐且pH大于9.0 时具有类似的洗脱效果。SP Sepharose FF在加盐且pH 大于5.0 时,洗脱收率大于90%;不加盐且pH 大于6.5 时,蛋白的洗脱收率大于85%。

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图6 给出了SP Sepharose FF 介质的典型结果,并比较了常规1 ml 填充柱的蛋白吸附和分离效果。结果表明,上样条件为pH 4.0,上样量77.5 mg·ml−1,洗脱条件为pH 7.0,微孔过滤板和常规填充柱的蛋白收率分别为90.0%和96.3%,二者保持一致。其他介质的结果类似,表明基于微孔过滤板的HTPD可以应用于色谱分离过程的优化。本文用的是纯蛋白,若对于实际料液,采用以上类似过程可以考察不同洗脱条件的蛋白纯度,从而确定合适的分离条件,达到高纯度和高收率的要求。


2.6 基于微孔过滤板的HTPD 优势和不足分析与传统层析分离过程优化相比,微孔过滤板法的优势体现在:①资源消耗减小,对于单一介质和蛋白,介质总需要量小于1 ml,蛋白量小于1 g;②实验通量增大,可以平行筛选多种色谱介质,系统性评价液相条件的影响,一次96 孔板就可以考察96 个不同的条件,为快速确定最佳条件提供参考;③研发周期缩短,一般过程优化的周期小于一周;④适用性广,可以进行介质筛选、吸附性能考察,吸附等温线和吸附动力学测定、吸附和洗脱条件优化等,涵盖色谱分离优化的全过程;⑤自动化程度和稳定性提高,进一步整合液体工作站,可以提高自动化处理能力,增大过程通量,同时减少人为操作影响,提高数据的稳定性和结果的重复性。由于是微量操作,也存在一些不足,主要体现在以下几个方面:①介质和溶液用量少,操作误差的可能性增大,实验中需要特别注意,并通过优化操作参数加以避免,还可以利用自动化液体工作站减小批次间差异;②实验通量大,样品多,分析检测耗时显得更加明显,采用或开发一些快速、自动的检测方法很重要,可以显著提高工作效率;③由于微孔板中介质量少,难以直接考察动态结合载量,可以利用吸附等温线和吸附动力学数据,通过数学模型间计算获得。以上几点不足,需要在实际应用中加以注意。

3 结 论

针对蛋白色谱分离,建立了基于微孔过滤板的HTPD 方法,应用于介质初筛、吸附性能考察、吸附等温线和吸附动力学测定、吸附和洗脱条件优化等过程。优化了96 孔过滤板的操作参数,以阴离子交换型介质(Q Sepharose FF 和Capto adhere)和阳离子交换型介质(SP Sepharose FF 和Capto MMC)为典型对象,采用微孔过滤板考察了BSA 的吸附和解吸条件。不同介质表现出不同的特征,整体而言与离子交换介质和混合模式介质的性质相符。分析结合载量分布图,发现阴离子交换型介质在BSA 等电点附近(pH 5.5)和高pH(8.5)低盐条件下有较高的吸附量,低pH(4.0)有助于蛋白解吸,而阳离子交换型介质在低pH(4.0)条件下有较高的吸附量,中性pH(7.0)有利于蛋白解吸,不过CaptoMMC 需要在高pH(9.0)高盐条件下实现有效洗脱。基于介质吸附条件的初筛,进一步采用96 孔过滤板测定了BSA 的吸附等温线和吸附动力学曲线,得到了吸附平衡参数和有效孔扩散常数,结果与常规方法保持一致。最后,采用96 孔过滤板优化了洗脱条件,得到合适的蛋白分离条件,结果与1 ml 填充柱的分离效果一致。结果表明,基于微孔过滤板法的HTPD 方法,可以快速、高效地筛选色谱介质和液相,优化蛋白分离条件,具有资源消耗小、实验通量大、研发周期短、适用性广、数据稳定性高的特点,后续将用于药用蛋白的分离过程研发。


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